应用案例 | 体式镜下3D影像的数码显示

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垂直分辨率的奥妙 —— 小付出，大回报

快速和易用是数码显微镜的主要特征之一，利用数码显微镜，即可轻松构建表面模型的宏观和微观结构。在定性评估中，这些宏微观结构可以令用户更好地了解样本，并对样本进行更详尽地记录。此外，表面的定量分析还将提供有关表面组分及其磨损情况的重要信息。那么，哪些样本适用于徕卡数码显微镜，而所用的检测方法又有何限制条件呢？
徕卡数码显微镜的三维成像技术基于自动变焦原理。使用光学器件的景深限定值确定样本的深度信息。样本相对于物镜的垂直位移，确定了焦点信息的同时，还能够确定其与光学器件的间距。针对每个垂直位置，将锐聚焦图像区域与模糊区域隔开，这两个图像区域都经由软件处理，以便构建表面模型。除了高度信息之外，采用该技术手段的优势还包括，记录样本的结构。成功构建三维表面模型有哪些决定性影响因素，以及这些参数又是如何影响横向和垂直分辨率的？

光学器件

在显微镜中，景深往往被视为一种经验参数。实际上，它是由数值孔径、分辨率和放大倍率之间的相关性确定的。为了得到最佳视觉印象，现代显微镜的调整选项会在景深和分辨率（在理论上，这两个参数具有负相关性）之间构成一种最佳平衡。
在DIN/ISO标准中，样本一侧的景深被定义为“样本平面两侧空间的轴向深度（在样本平面中，样本可以移动，图像聚焦的清晰度不会受损，同时图像平面和物镜的位置保持不变）。”但是，上述标准并未提供任何提示，阐明如何测量焦点恶化的检测界限值。尤其是放大倍率较低时，景深可以通过缩小镜头光圈（即减小数值孔径）而显著增加。这通常是通过孔径光阑或孔径光阑共轭平面上的光阑来完成的。然而，数值孔径越小时，横向分辨率就越低。因此，问题是找到分辨率与景深（取决于样本结构）之间的最佳平衡。

样本结构

样本表面结构包含样本的所有部分的特性，包括表面的色彩和亮度特性。如前所述，自动变焦原理建立在有条理的方法基础上。样本中清晰和离焦区域划分得越明确，表面模型的效果就越好。该方法特别适用于反差度好的结构。在很多显微镜应用领域，照明都占据重要地位，常常是决定成败的关键所在。如果选择的照明方式适当，即使样本的结构非常少，亦可对其进行记录。例如，可以选择倾斜入射光照明方式，令隐藏的微小结构清晰可见。

垂直方向上的机械分辨

在这个等式中，第三个影响因素是垂直方向上的机械分辨率，该术语表示调焦驱动器（通常为电动） z 轴上的最小可能步距。为了充分发挥光学器件的性能，最小可能步距必须小于当前所用景深，否则，图像数据就会丢失。例如，电动调焦驱动器分辨率为 10μm，则适当景深为 15μm。
Leica DVM 系统的横向和垂直分辨率取决于各种不同的影响因素，例如，表面结构或照明器，因此，必须根据应用领域予以确定。利用插值法获取一半应用景深的垂直分辨率。由所用放大倍率的数值孔径来确定横向分辨率。

景深 —— Berek 公式

在视感景深这个问题上，Max Berek 是第一位发表观点的作者，早在 1927 年他就发表了经过大量实验得来的结果。Berek 公式给出了视觉景深的实际值，因而沿用至今。Berek 公式的简化形式如下：

TVIS：视感景深
n：样本位于其上的介质的折射率。如果样本被移开，则在公式中输入介质的折射率，该介质形成变化的工作距离。
λ：所用光的波长，对白光来说，λ = 0.55μm
NA：样本一侧的数值孔径
MTOT VIS：显微镜的视觉总放大倍率

如果以上方程中，视觉总放大倍率为有效放大倍率所取代（MTOTVIS = 500-1000 x NA），则可以看出，景深的第一个近似值与数值孔径的平方成反比。

照明

选择适当的照明方式对于实现成功检测至关重要。徕卡显微系统的标准化设计，令您可以为所选光学器件搭配最佳照明方式，满足特定应用领域的需求。您可以选择如下照明方式：

可变倾斜入射光照明

该方法可以改变照明方向：垂直-横向。这种照明方式尤其适用于观察划痕或小的凹槽。